什么是稳转？？？

稳转细胞系指在细胞中持续稳定表达特定基因或干扰特定基因的表达。用脂质体转染法或慢病毒侵染的方法将构建好的含靶基因的载体导入细胞，根据不同的基因载体中所含的抗性标志选用相应的药物（如G418, Zeocin, puromycin）进行筛选混合阳性克隆。在阳性混合克隆的基础上，得到单细胞长出的阳性单克隆，继而得到稳转转染细胞株。稳转细胞株的目的基因质粒DNA整合到细胞染色体上，使细胞长期稳定表达该基因。

      原理很简单，可是实际操作起来却不是那么容易的，在具体实验中应该注意的问题主要有几个方面（吸取大家的经验可以减少很多弯路哦）：

筛选之前需确定G418浓度

由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1 g 的粉剂中有效的G418含量大约为0.722 g。G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。

汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%。

G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体为：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100 ug/ml~1 mg/ml 的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。

加药时间和维持浓度

由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。这时药物浓度可以降至200 ug/ml。

其次是加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。一般是转染48小时后加入抗生素。挑出单后就可以用维持浓度，一般是筛选浓度的1/2。

筛选时的培养液

加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无几。这时会出现两个问题：

1. 死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，即非选择性死亡，因此要及时换液。

2. 孔中细胞数目很少，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死亡。这个时候需要一种特殊的培养液：假如你要转染3T3细胞，在3T3细胞汇合度达到80%的时候，换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消毒，和新鲜的培养液按1：1混合备用。再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。

单化后的鉴定

稳定转染细胞，通过PCR鉴定，发现目的基因并不上调，瞬时转染表达是增高的。原因：瞬转是在强启动子下，稳转时你得到的细胞株可能失去了此启动子，或者是改变了细胞的生理特性!用WB和瞬转对照鉴定一下！

转染后质粒整合到基因组是随机的，一般两月后（传代10代以上）还表达你想要蛋白的单可以认为是整合了质粒的。