Western Blot 是分子生物学中研究蛋白的经典方法，被广泛应用于检测细胞或组织样本中蛋白的表达量或者修饰情况。随着文献发表的要求越来越高，传统的定性或者半定量已经无法满足研究者对于western blot高质量的数据要求，研究者更多的是追求Western Blot的重复性、定量的准确性。对于定量的准确性而言，均一化的选择就显得尤为重要。

Western Blot实验中的均一化分析，用以校正不同样本之间、不同泳道之间的差异，获得准确、可重复的Western Blot数据。常见的均一化方法包括：看家基因、总蛋白染色、信号蛋白（如磷酸化等蛋白修饰研究中信号蛋白）等均一化方法等。

最常用也是最经典的方法是用看家蛋白做内参进行均一化，看家蛋白又称管家蛋白，一般被认为在所有的组织中表达恒定且不受实验条件的影响，主要包括 Actin/Tubulin/GAPDH等，但是近年来越来越多的研究表明，在某些实验条件下，看家基因的表达会因不同类型的组织来源、不同的发育阶段、或不同的实验条件而变化。另外，用看家蛋白进行均一化需要注意信号饱和的问题，因为一般情况下看家基因表达丰度相对于目标蛋白丰度较高，两种蛋白可能存在不同的线性范围，为此实验人员往往需要调整上样量。因此在Western Blot实验中，用来进行均一化的内参是否合适，是否可以作为绝对定量的均一化的标准？是需要研究者首先在心中打个问号的。那么如何确定选择的内参是否合适？——LI-COR 提供的 Odyssey® Loading Indicators（OLI）可以帮助您解决这个问题。 Odyssey® Loading Indicators 是一个标记了 IRDYE 700/800近红外荧光染料的28KDa 的外源重组蛋白质，在电泳上样前与样品按照一定的比例混合上样，随后在western blot 结束之后可以实现在Odyssey 近红外激光成像系统上进行观察。通过外源加入的 Indicators 的荧光值可以判断不同泳道之间：a、上样的一致性；b、转膜效率的一致性；c、内参蛋白的表达是否可以作为均一化的标准。

REVERT™ Total Protein Stain 作为均一化的标准与内参蛋白相比具有如下优势：首先， REVERT™ Total Protein Stain可以适用于任何的生物条件下，消除了不同生物条件下内参蛋白表达不恒定的影响；其次，消除了内参蛋白Stripping或者跑两块胶带来的变异差异；另外，内参蛋白一抗的批间差异也会造成实验结果的重复性问题，而总蛋白染色则避免这一问题。

与其他总蛋白染色方法相比，REVERT™ Total Protein Stain 也具有很明显的优势，例如普通的考马斯亮蓝染色，是不可逆染色，往往需要同时跑两块胶，一块胶进行染色另一块胶进行后续免疫试验，存在不能校正转印差异的问题，而REVERT™ Total Protein Stain 则是在PVDF/NC膜上进行可逆染色；虽然丽春红染色是可在膜上进行总蛋白染色，但丽春红染色的灵敏度和线性范围与REVERT™ Total Protein Stain 则相差很远，不能作为精确定量的均一化选择； Stain Free等染料，是对胶上或膜上总蛋白进行染色，但由于其与蛋白是共价不可逆结合，因此可能会影响抗体与靶蛋白的结合，并且在膜上的背景较高、线性范围也比较窄，而且需要特制的预制胶，增加了实验成本，而REVERT™ Total Protein Stain 则是可逆反应，不影响后续抗体结合，非常容易实现在Odyssey系统上的双指标同时定量，并且不需要改变原有的实验条件和实验体系，是一种既经济又准确的均一化方法。