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免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。

1、滴加 0.01 mol/L，pH 7.4 的 PBS 于待检标本片上，10 min 后弃去，使标本保持一定湿度。

2、滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30 min）。

3、取出玻片，置玻片架上，先用 0.01 mol/L，pH 7.4 的 PBS 冲洗后，再按顺序过 0.01 mol/L，pH 7.4 的 PBS 三缸浸泡，每缸 3~5 min，不时振荡。

4、取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。

5、立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用「+」表示：（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++--++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达「++」以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。

实验注意事项

1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。

2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。

3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。

4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。

5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。

6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。

1、抗体。低温运输，接收后按说明书要求   存放于4℃ 或-20℃ ，带荧光的切记避光。

2、样本。石蜡切片常温运输，接收后常温储存； 冰冻切片低温运输，接收后保存于-20℃；细胞/细胞爬片应固定后，浸入PBS中。（强烈建议用四孔板培养且密度在70-80% ）。

免疫荧光双标的经验之谈

1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。

2、我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要自我摸索，我感觉一抗4℃孵育过夜比较好，背景比较清晰。

3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。

4、封闭血清是二抗来源动物的正常血清，我用的是10%正常donkey血清。

5、其余事项同免疫荧光单标操作。

服务项目

1. 可提供组织取材、组织固定及组织包埋等前期服务，再进行免疫荧光检测

2. 接收客户的细胞爬片或组织切片，进行免疫荧光检测

石蜡切片脱蜡至水→ 高压抗原修复→ 灭活内源性过氧化物酶→ 封闭→ 一抗孵育 → 荧光素标记二抗孵育 →荧光显微镜镜检