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题目：BMSC原代取材及Sclu基因在BMSC中的作用
Title：Secreted Clusterin protein inhibits osteoblast differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells by suppressing ERK1/2 signaling pathway
介绍
BMSCs是一种成年干细胞的亚群，存在于骨髓中特定的血管周围的小凹出。具有自我更新和多功能分化的能力，可分化形成成骨细胞，脂肪细胞和软骨细胞。在临床研究中，BMSCs可由于非愈合骨折，颅骨、口腔颌面骨重建及增强。
原代取材
BMSC成骨分化诱导
状态良好的BMSC细胞，以1.5*103/cm2接种细胞，至细胞融合度达到70%，加入成骨诱导液（α-MEM中含有10%FBS，100U/ml青霉素，100mg/链霉素，50微克/ml的维生素C和10mMβ-甘油磷酸钠），2-3天换液一次，成骨时间在12天左右。用茜素红染色鉴定。
BMSC成脂分化诱导
状态良好的BMSC细胞，以1.5*103/cm2接种细胞，至细胞融合度达到100%，加入脂向分化诱导液（DMEM中含有9%的马血清，450微摩尔IBMX，250nM地塞米松，5微克/ml胰岛素和1微摩尔罗格列酮）。2-3天换液，12天后检测。油红染色检测。
ALP活性检测
细胞在含有 P-硝基苯磷酸的碳酸盐缓冲液中反应，在样品中的碱性磷酸酶作用下， P-硝基苯磷酸分解成P-硝基酚和磷酸，生成的P-硝基酚为碱性，呈黄色。根据测量405nm处的吸光光度值，计算出碱性磷酸酶的活性。
成骨检测（茜素红染色）
试剂配制：0.2%茜素红染色液（货号：G1450 规格：100ml/500ml 保存：2-8℃，有效期6个月）
步骤：
1.PBS清洗细胞样本。
2.10%中性福尔马林或乙醇固定10-30min。
3.吸去固定液，PBS清洗细胞样本两次。
4.滴加茜素红S染色液，覆盖样本，染色1-5min。
5.吸去染色液，PBS洗涤两次。
6.镜下观察：钙沉淀阳性细胞呈现桔红色。
注意事项：
1.试剂溶液在样本表面时，避免有气泡存在，同时确保铺满样品表面。
2.茜素红S染色时间根据钙盐的含量来确定，可在显微镜下面观察，见钙盐成较深的橘红色即取出洗涤，如染色液时间过长，可能出现弥散现象。
成脂检测（油红O检测）
试剂配制：油红O 0.5g ；异丙醇（含量98%） 100ml 饱和液可长期保存备用
步骤：
1.冻切片，蒸馏水充分洗涤。
2.油红O稀释液（取油红O饱和液6ml,加蒸馏水4ml，静止5-10min后过滤后使用）染色10-15min,避光，密封。
3.60%乙醇镜下分化至间质清晰。
4.苏木素染细胞核，水洗。
5.甘油或甘油明胶封片。
注意事项：油红O染色时应避免试剂挥发过多，否则易形成背景沉淀。
结果：脂肪呈现鲜红色，细胞核呈蓝色，间质无色。
SiCLU基因在不同处理中的表达
A：qPCR检测在不同组织中SiCLU的表达
B：qPCR检测在不同时间点BMSC的脂肪细胞分化过程中SiCLU的表达
C：ELISA测量和western blot检测在脂肪生成过程SiCLU蛋白的分泌
D: qPCR检测在成骨诱导中不同时间点SiCLU的表达
E：ELISA测量和western blot检测在成骨过程SiCLU蛋白的分泌
SiCLU促进bmscs细胞增殖，A： SiCLU对骨髓间充质干细胞增殖的影响，细胞培养12天，使用血细胞计数器计算细胞数。
siclu对mBMSCs的脂肪细胞分化有促进作用
(A)剂量依赖的感应效果，可溶性CLU(0.5 - 5μg /毫升)在脂肪细胞的分化过程中，用定量油红O染色法测定10天后的脂肪积累。
(B) siclu对mBMSCs脂肪生成的刺激作用。在12天的分化过程中。细胞诱导的脂肪生成在缺失(−sCLU)和存在sCLU重组蛋白(5μg /毫升)。每个时间点用油红O染色的图像。
(C) 12天后mBMSCs中脂肪标记性基因表达的qPCR分析。在缺失(−sCLU)和存在sCLU重组蛋白在下进行脂肪诱导。
siclu对mBMSCs的成骨细胞分化有抑制作用
(A)用碱性磷酸酶活性(ALP)和(B)茜素红染色6天后和12天成骨诱导。ALP和茜素红染色图像显示。茜素红色的测量值被标准化到细胞数量。
(C)在缺血后12天诱导mBMSCs诱导成骨标志物表达的qPCR分析。(-sCLU)和sCLU的存在(+ sCLU)(5μg /毫升)。
【结论】数据显示， SiCLU促进bmscs细胞增殖，在mBMSCs的脂肪细胞分化过程中siclu分泌明显增加，并发挥了作用。在成骨生成中siclu分泌减少，抑制BMSC成骨细胞分化的作用。
实际操作中出现的问题
原代取材：
1.取股骨和胫骨时，尽量保证完整性，附着的肌肉及软组织不好剔除可以允许少量残余，尽量缩短取材时间。
2.细胞汇合度达到80%-90%，细胞传代。（细胞接种不均匀，容易形成克隆群，根据克隆群的情况可以重新接种）。
3.根据文献可知细胞传代消化时间不能过长，一般放在37℃1分钟即可，消化时间长，影响细胞活性。但实际情况消化3-5分钟，且细胞不易吹落，造成细胞量的减少，传代后细胞增殖速度。
4.血清浓度需要检测，根据文献血清含量10%即可，含量15%的血清 中细胞空泡增多，细胞趋于老化。年前老师建议血清浓度为15%，细胞状态比较差。
5.细胞接种密度不宜过低。
病毒感染：
1.骨髓间充质干细胞属于难感染细胞，感染复数MOI=100左右，要求病毒滴度高于8。
文献下载：Secreted Clusterin protein inhibits osteoblast differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells by suppressing ERK1/2 signaling pathway
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