题目：神经元样分化的SH-SY5Y细胞适应温和短暂H2O2诱导的氧化应激

Title：Neuronal-like differentiated SH-SY5Y cells adaptation to a mild and transient H2O2 -induced oxidative stress 

实验结论：

1.神经元样分化的SH-SY5Y细胞对H2O2诱导的氧化应激敏感，且细胞在100μM浓度以下H2O2处理24h内可刺激PC反应对抗氧化应激；

2.这种细胞类型可以作为一种合适的体外模型来进一步关注PC反应；

3. 由于PC在神经元样分化的SH-SY5Y凋亡和炎症途径的细胞保护中起重要作用，氧化损伤的发展，在体内与衰老和缺血后脑损伤相关。 因此，这些结果可能有助于为药物治疗提供一个思路，希望能够开发靶向涉及这种内源性神经保护策略的信号转导途径。

研究背景

过氧化氢诱导的氧化应激产生的活性氧(ROS)， ROS是一种普遍存在的自由基，被认为是细胞功能和信号的生理标志。ROS的产生与内源性抗氧化系统清除ROS之间的不平衡导致氧化应激，导致与年龄相关的疾病，如神经退行性疾病、癌症和糖尿病，以及缺血/再灌注后继发性损伤的发展。

预适应（PC）是1986年美国学者穆里（Murry CE）等提出的，他们在研究犬心肌缺血模型时，发现阻断冠状动脉5分钟再灌注5分钟，反复4次之后可使再阻断冠状动脉40分钟所致的心肌梗死范围比对照组减少75%。这种保护性反应，被认为是一种内源性的适应性保护机制，以应对短暂的亚循环缺血和间歇性再灌注，从而产生更有效的保护机制。

体外预适应的方法是在轻度和短暂的氧化应激后施加长期的氧化条件，这种氧化应激可能是机械性的(热休克、拉伸、超声、激光辐射或磁场)，也可能是生物的(缺氧和营养缺乏或低浓度过氧化氢(H2O2)的氧化应激)。

研究目的

由于预适应对神经细胞涉及多种尚未完全了解的保护机制，本研究的目的是验证神经母细胞瘤SH-SY5y细胞所获得的神经元样分化细胞，与其他神经细胞相比，能否适应轻度和短暂的H2O2诱导的氧化应激，从而产生PC反应，对抗氧化应激产生有害作用。

通过监测细胞活力、细胞大小、凋亡(Bcl-2、Bad)和炎症(INOS)通路以及抗氧化系统(MnSOD)来确定最低H2O2浓度。其目的还在于确定H2O2浓度的上限和保护浓度，因为保护时间的持续与信号通路的激活在体内缺血发作后pc反应中起着关键作用。

实验内容

1.SH-SY5Y细胞培养及MTT测定H2O2处理细胞后的细胞活性

a.用含10% 胎牛血清, 1% 双抗, 1mM丙酮酸钠, 2mM L‐谷氨酰胺的 MEM/Ham‘s F‐12 培养基培养，每两天换液，保证所有细胞培养条件一致。

b.用含有1%胎牛血清的完全培养基重悬细胞，按4 × 10 4 个细胞接种到96孔板中，孵育24h。用维甲酸(100 nM)诱导细胞分化，一旦细胞分化 ，加H2O2处理。

2.PC实验

MTT测定细胞被低浓度H2O2(10μM-50μM)预处理6小时或24小时，然后用较高浓度的H2O2(100μM~300μM) 作用24小时后细胞活性。

实验分组如下：

a.对照组(CTR)：分化细胞，不加H2O2刺激； ·

b.10μM H2O2 PC组：10μM处理的分化细胞前6或24小时后H2O2(100μM或 200μM或300μM H2O2)在作用24h；

c.20μM H2O2 PC组： 30μM H2O2 PC组； 50μM H2O2 PC组。

左图为正常形态；右图为分化的细胞形态

维甲酸作用后，细胞由原来的三角形或者多角形形态转变为具有较长的细胞突起的形态。

3.细胞大小测定

制备细胞切片，在光学显微镜下测量细胞大小。每组实验至少测量30个，求平均细胞大小。

4.Western blot 测定相关蛋白的表达水平

Western blot测定Bcl-2（抗凋亡）、 Bad（促凋亡）、 iNOS and MnSOD（炎症路径）的表达量。

实验结果

1.H2O2处理对细胞活性的影响：

实验结果：不同H2O2浓度（10μM~300μM）分别处理细胞2h、6h、24h后检测细胞活性。在处理细胞2h 、6h时H2O2对细胞活性没有影响，处理24h，高浓度的H2O2（100μM~300μM）对细胞活性剂量-时间依赖性作用。

低浓度的H2O2（ 10μM~50μM）在处理细胞6h、24h没有诱发细胞死亡，可作为预适应的H2O2浓度。

2. PC实验结果：

实验结果：

(1). 高浓度H2O2单独处理组与对照组相比，细胞活性显著降低；

(2). 不同剂量低浓度H2O2预处理6h后，高浓度H2O2处理24h，细胞与高浓度H2O2单独处理组相比，细胞活性没有显著变化；

(3).不同剂量低浓度H2O2预处理24h后，随后200μM和300μ H2O2处理24h，细胞与高浓度H2O2单独处理组相比，细胞活性没有显著性差异，而100μM处理的细胞，细胞活性有所提高。

鉴于以上结果，预适应低浓度H2O2 （10μM~30μM）处理24h后100μM H2O2处理24h还有更深的研究。

3. 预适应对细胞大小的影响：

图注：预适应处理24h(10μM~30μM)后，100μM H2O2处理1h(A)、6h(B)相对正常组细胞大小；正常组（C）； 100μM H2O2单独处理6h（D）；10 μM H2O2处理24h后100μM H2O2处理6h（E）。

实验结果：

(1).100μM H2O2单独处理细胞1h或者6h，与对照组相比，细胞大小显著降低；(2).预适应处理细胞24h后， 100μM H2O2在处理1h或者6h，与100μM H2O2单独处理组相比，细胞大小显著增加，而与正常组相比没有太大变化。

(3).预适应处理细胞24h后， 100μM H2O2在处理24h细胞大小不能确定，细胞损伤后形态显著变化。

4. Bcl-2和Bad蛋白的表达:

实验结果：

(1).用10μM或20μMH2O2单独处理细胞24小时与未处理的细胞相比Bcl-2、 Bad表达水平没有显著变化，而30μMH2O2处理Bcl-2表达水平降低， Bad表达水平升高（数据未显示）；

(2).100μM H2O2单独处理细胞，Bcl-2表达水平降低， Bad表达水平升高；

(3).用10μM或20μMH2O2预处理后用100μM H2O2处理后， Bcl-2表达水平较100μM H2O2单独处理组显著增高，与正常组相比差异不大，而30μMH2O2预处理组与100μM H2O2单独处理组相比， Bcl-2表达水平没有显著差异，而低于正常组；

(4).10μM H2O2预处理组较100μM H2O2单独处理组，Bad水平明显下降， 20μM 和30μM H2O2预处理组与正常组相比， Bad水平明显上升。

5. iNOS and MnSOD蛋白的水平:

实验结果：

(1).用10μM或20μMH2O2单独处理细胞24小时与未处理的细胞相比、 iNOS水平没有显著变化，而30μMH2O2处理. iNOS表达水平升高（数据未显示）；

(2). 100μM H2O2单独处理组iNOS表达水平明显高于对照细胞，也高于10μM H2O2预处理组；与20μM 和30μMH2O2预处理组表达相当。

(3).处理组与对照组相比，MnSOD蛋白水平没有没有显著性差异。

实验讨论

1.本研究的目的是验证神经元样分化的SH-SY5Y细胞是否能适应轻度和短暂的H2O2诱导的氧化应激，从而产生PC反应，对抗氧化应激的有害作用。 H2O2可能根据细胞靶点及其浓度范围表现出多种效应，因此，第一个目标是选择溶解浓度来诱导损伤，而不是选择溶解浓度来刺激PC反应。

2. 细胞形态学监测进一步证实了神经元样分化的SH-SY5Y细胞对氧化应激的适应。 H2O2作用后的细胞收缩是细胞凋亡的标志，由离子通量激活介导。由于PC反应参与了神经元样分化的SH-SY5Y细胞大小的恢复，因此可以合理地考虑离子传导在适应过程中的作用以及在脑卒中和脑外伤中的药理靶向作用。

3.细胞凋亡和炎症途径在一脑缺血或创伤性脑损伤后继发损伤起关键作用。

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