流式细胞检测

    利用流式细胞仪，以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术。

    可检测的样本：

    a.各种细胞（如外周血，骨髓，细针穿刺，灌洗液，实体组织，悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球等；

    b.血清、血浆、培养上清、细胞裂解液；

    流式检测细胞凋亡

    1.样品处理：

（1）取对数生长期细胞，胰酶消化；

（2）终止消化反应，同时吹打使细胞完全分散，离心弃上清；

（3）PBS洗2次，加结合缓冲重悬，调整细胞浓度为1×106个/ml；

（4）取4支流式管，每管加100 μl细胞悬液，并编号1、2、3、4；

（5）2号管加入5 μl  Annexin V-FITC，3号管加入 5 μl PI，4号管分别加入5 μl  Annexin V-FITC和5 μl PI轻轻混匀；

（6）室温(20-25℃)避光孵育 15 min；

（7）每管加 400 μl 结合缓冲液；

（8）300目（孔径40-50 μm）尼龙网过滤，1 h 内上机检测。

    2.上机检测及数据处理：

    常见问题

    Q1.无法标记

(1).确保所有的抗体都按照厂商的说明书正确存储。

(2).确保商品化抗体没有超过有效期。

(3).确保已正确加入足量的抗体。

(4).确保抗体已连接荧光素。如果未连接荧光素，需加入连接有荧光素的二抗。

(5).确保二抗是好的，也就是说二抗曾经能与另外的一抗成功结合。

(6).确保使用了正确的二抗，就是说二抗能够识别你的一抗。

(7).如果使用的是PE或APC荧光素的抗体，确保该抗体未被冰冻过。

(8).你要检测的组织上是否表达该抗原？可查看相关文献了解该抗原的表达情况，或者同时做一个阳性对照。

(9).抗体是否能识别检测物种的抗原位点？可检查抗体的交叉反应列表（例如http://www.biolegend.com/cross_reactivity），看看抗体是否适用于你要检测的物种标本。不是所有的抗体都能够检测所有物种相应抗原。

(10).确保使用正确的激光来激发荧光素，并使用了正确的通道来检测该荧光。

    Q2.PE抗体无法标记，而FITC抗体的结果却很好

(1).PE荧光素可能冰冻过。如果冰冻过，建议另外买一管新的抗体。

(2).多聚甲醛（PFA）可能会导致此问题。PFA降解后可释放出甲醇，从而影响染色。所以切记PFA尽可能新鲜配制，或者细胞尽可能不要固定，染完色就立即检测。

    Q3.非特异性染色

(1).非特异性染色可能是由于自发荧光。

解决方法：用一管只加细胞不加抗体的空白管，查看细胞自发荧光水平。

(2).某些细胞可表达低亲和力的Fc受体CD16/CD32，这种受体可通过Fc片段结合大多数抗体。对于小鼠细胞，可使用SeroBlock FcR阻断该位点。

(3).非特异性染色也可能是由于二抗引起，建议选择一种只与一抗反应、却不会与检测组织发生交叉反应的二抗。

(4).确保洗涤充分。

(5).小心滴定抗体。降低抗体浓度可减少非特异性染色。

    Q4.荧光强度弱

(1).荧光弱可能是由于抗体过度稀释。因此使用前通过正确滴定抗体，以确保抗体浓度适当。

(2).直标时，荧光弱也可能是由于前带现象引起（概念见表格后解释），因此，小心正确滴定抗体很有必要。

(3).荧光弱可能由于细胞数量过多。建议正确调整细胞密度，一般低于1×10E7/ml。

(4).荧光弱可能是由于抗原本身就表达低，可通过查阅文献，明确抗原表达水平。

(5).如果查阅到该抗原确实本身表达弱，那么建议选择更亮的荧光素（荧光素亮度排行见：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2367-1-1.html）。

(6).在交叉反应明显的抗体中，其荧光强度弱于特异性高的单克隆抗体。

(7).一抗或二抗的孵育时间和温度均需优化。

    Q5.散射光异常

(1).确保细胞是新鲜收集的，否则容易出现大量死细胞和碎片。

(2).对细胞进行刺激、活化时，可影响细胞散射光特性。

(3).如果要裂解红细胞，确保裂解液新鲜配制并且配制正确。

    Q6.结果与预期的相反

(1).有些试剂可能会影响某些抗原检测，例如EDTA可影响一些血小板标记的检测。

(2).裂解液也可以影响一些抗原检测，此时可采用PBMC提取法试试。

(3).有些抗原是表达在胞内的，故需选择正确的破膜剂进行正确的破膜处理。