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养细胞日常答疑篇
一、如何判断细胞污染了？
状态 1： 细胞培养液变浑浊了，经常见到是米汤样，黄色液体，一般认为细菌污染。
状态 2：细胞培养基内含有能动的小黑点，一般认为是黑胶虫。
状态 3：胞培养基清亮，但是能看到飘在培养液带有毛毛的白色的菌状物质，有可能就是真菌感染。
策略：细胞污染了就直接扔了，还得把培养箱用酒精棉球擦干净，并用紫外照射半小时，防止再次污染。同时建议细胞培养时，在培养基中加入青链霉素 (尤其是初学者)
二、细胞周围包括细胞上有很多小黑点，怎么办?
策略 1：用胰酶消化下来后，低速短时间离心，不同实验室不一样，如果平时是 1 000 转 5 min 的话，就可以改为 700 转 3 min，用新的培养瓶培养细胞，细胞收集是少一点，但是一般都能干净很多。多传几代就好多了。
策略 2：如果多次尝试之后还是不干净，就怀疑是否存在支原体污染了，用抗支原体药就 OK 了。一般用上 3～5 天，细胞就干干净净了。
三、贴壁细胞表面沾了很多死细胞，传代过程中一直存在怎么破？
有一招屡试不爽，那就是用 PBS 洗两遍之后，加胰酶进去，晃一晃，迅速将胰酶倒出，再用 PBS 洗一下，再加胰酶正常消化。死细胞由于粘附能力很弱，第一次加胰酶进去以后会掉下来，第二次加胰酶下来的细胞才是活性比较强的细胞。整完一次之后，再次传代方法同上，一般 2～3 次之后，细胞就完好如初了。
四、细胞状态不好，养不起来，怎么办?
策略 1：一般情况下，从血清下手就行，要么换好血清，要么提高血清浓度，血清浓度提高到 15%～20% 培养 48 h，换成正常 10% 的浓度，用高浓度的血清培养时间过长对细胞有毒性。
策略 2：血清下手之后可以同时采取提高细胞密度的方法，从培养瓶换到六孔板，12 孔板等，细胞密度大，细胞分泌的细胞因子多，肿瘤细胞通过旁分泌途径促进细胞生长。
预防策略：细胞胞质疏松，老化的原因在于细胞传代次数比较多，胰酶消化时间太长，这时候，一定要控制细胞传代次数，注意胰酶消化时间，胰酶消化时间过长，容易导致细胞状态不佳以及胞质疏松。有一招，元元没试过，可以尝试，将细胞冻起来，过段时间复苏，细胞会长得比较好。
五、长途运输过来，装满培养液的细胞如何处理?
很多人都会遇到从其他地方买来细胞或者快递运来细胞，装满培养基的培养瓶的细胞怎么处理的问题。
第1步：先放 37℃ 培养箱放置 4 小时，这样细胞在通过长途跋涉以后得以稳定，观察细胞状态。
第2步：将新鲜培养基和旧的培养基 1:1 稀释，如果细胞状态不好，可以将血清浓度提到 15%，否则正常培养，这样有一个过渡期，不至于细胞换血清之后状态不佳，15% 的血清培养 48 h 之后换成正常浓度培养。
养细胞污染预防篇
一、无菌观念薄弱，穿戴不注意
进细胞房不换鞋，不戴口罩，不戴手套，这其实是细胞房的大忌讳！有更严格的细胞房连帽子都要戴上。为什么呢？换鞋是为了隔离真菌。戴口罩是为了防止口腔支原体不会污染细胞了。不戴手套，根本就清除不掉你手上的细菌真菌，要不你试试看拿火燎一下你的手，焦了才算灭菌。
二、紫外线和酒精灭菌，不能乱用
能灭菌，但是紫外和酒精最多只能灭细菌，对真菌伤害很小。你不戴手套，仅用喷壶喷手是没有什么用的。超净台为什么尽量要用酒精棉球而不是用酒精喷壶呢？因为用酒精棉球的话，可以在灭菌的同时把菌体从手上擦下去。而喷壶只能短暂灭菌而已，所以要多用棉球，少用喷壶。
三、使用生物安全柜，别超安全线
生物安全柜的玻璃窗是有警戒线的，超过这个警戒线，生物安全柜的风帘就起不到太大作用，且会引入室内空气中的真菌，比如你的臭鞋里的酵母啥的。还会让你给细胞送温暖的呼吸里，自动带上支原体。
四、拿细胞培养瓶的时候不注意操作
用细胞培养瓶来培养的时候，最忌讳的是你拿瓶子的时候，手拿着有盖子的那一面。因为一般来说瓶盖开关是最容易接触到瓶口的，你手拿着培养瓶，那手的虎口夹缝里所含有的真菌很容易就接触到瓶盖上，一旦造成污染，就是很严重的。
五、实验用品乱摆放
生物安全柜里操作的时候，门前最忌讳堆一堆杂七杂八的东西，枪头盒、血清、管子，培养皿、移液器、酒精喷壶、酒精灯，堆了一大堆。有的都堵住了安全柜门前的出风口。一来会导致操作起来并不是井井有条，会导致动作幅度过大，扰乱气流。二来这些东西一旦挡住风口，也会扰乱生物安全柜的气流，气流变化会导致外部不洁净的空气流入，也同样会导致生物安全柜的洁净作用失效。
六、不注意清洁水浴锅
水浴锅是比较容易忽视的，复苏细胞的时候，37℃，对细菌真菌来说这就是温床啊。复苏完，湿漉漉的冻存管，任你再怎么喷酒精也并没有什么意义了。那要怎么办，水浴锅一来是定期清洁，二来是加一些抑菌剂。注意：不是让你往里面加双抗！水浴锅里要加2%的硫酸铜，但这个是比较容易腐蚀水浴锅的，所以定期也要更换清洁。
七、水盘污染
培养箱的水盘也是坐拥37℃温床的水环境。水盘里若是飘着特别大的一块块霉斑。一污染就一箱子全报废了，培养箱要定期用0.1%的新洁尔灭或者84清洗（交替使用，防止微生物耐药）。水盘也一样，水盘中加入饱和的磷酸氢二钠可以有效预防细菌真菌，但是需要定期加入去离子水防止析出。
八、灭菌灭不好
细胞房所使用的枪头，必须要经过湿热灭菌， 用报纸包裹好枪头，是因为灭菌锅一般在细胞房外面，所以要保证内部枪头盒结晶。烤干是为了防止内部有水分，当你开启枪头盒后，有水的地方更容易被霉菌的孢子所接触附着，也就更容易污染。所以这个也必须要注意！
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