聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。 SDS-PAGE是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠），对蛋白质进行量化、比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。

    SDS-PAGE是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。SDS是一种阴离子去垢剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。由于SDS带有大量负电荷，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖,从而消除了蛋白质分子之间电荷差异。

    (1)将蛋白质样品与5X样品缓冲液(20ul+5ul)在一个eppendorf 管中混合。放入100℃加热5-10min，离心取上清点样。

    (2)将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddH2O冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干。

    (3)组装好玻璃板：固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板。

    (4)按表格1，根据要检测的蛋白的分子大小，选择相应的分离胶浓度，按表格2的配方进行配制。配制过程要迅速，催化剂TEMED要在注胶前再加入，否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。

    (5)向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20 min后胶即可聚合。水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡。 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。

    (6)按表格3配制浓缩胶。

    (7)将分离胶上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳。注意，样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。

    (8)装好电泳系统，加入电极缓冲液，将样品梳拔去，上样。上样前请确保锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果。另外，上样过程中注射器不可过低，以防刺破胶体，也不可过高，在样下沉时会发生扩散。 为避免边缘效应，最好选用中部的孔注样。

    (9)稳压200V，溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需45 min～1hr. 最后，小心的将胶剥离玻璃板，进行下一步实验。

    常见问题

    1.提高 SDS-PAGE 电泳分辨率的途径？

    (1)聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或 4 度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致 SDS 结晶。一般凝胶可在室温下保存 4 天，SDS 可水解聚丙烯酰胺。

    (2)一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。

    主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。

    处理办法：待其充分凝固再作后续实验。

    主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。

    处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。

    主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。

    处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。

    主要是样品不溶性颗粒引起的。

    处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。

    「鬼带」就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在 WB 反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。

    处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的 DTT 或 Beta 巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量 EDTA 来阻止还原剂的氧化。

    我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。

    处理办法：更换正确 pH 值的 Buffer；降低分离胶的浓度。

    电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。

    处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的 pH 正确（6.7）；适当降低电压；

    这种现象一般初学者易出现。比如电压 50v 以上，可电流却在 5mA 以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a. 内外槽装反；b. 外槽液过少；c. 电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。

    处理办法：电泳槽正确装配即可。

    这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。