细胞量不够?细胞碎片太多?
导致实验一次次重复?盘他!
教你如何把细胞周期的数据
变的更加漂亮,准确!
细胞周期简介
流式细胞仪是检测细胞周期最常用的方法,细胞周期是指细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的时间,它代表着生命从一代向下一代传递的连续过程。
主要分为以下2大过程:
▲分裂间期:间期又分为三期、即DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)与DNA合成后期(G2期);
▲分裂期M期:细胞分裂期,指细胞分裂开始到结束。
实验步骤
1. 细胞培养:取对数生长期的细胞,按1×106cells/ mL以1mL接种24孔板或2mL接种于6孔板内,进行所需的处理(比如加入药物),特定时间后终止培养,进行下一步的实验。
2. 细胞固定:800rpm离心5min,收集细胞沉淀,弃上清,用预冷PBS洗涤两次,加入预冷75%乙醇,于4℃固定4h以上。
3. 细胞染色:800rpm离心5min,弃上清,以3mL的PBS洗涤一次,加入400uL溴化乙锭(PI,50ug/mL),100ulRNaseA(100ug/mL ),4℃避光孵育60min。
4. 流式分析:以标准程序用流式细胞仪检测,一般计数2~3万个细胞,结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。注:上机前要以50um尼龙网膜或35um细胞过滤器过滤细胞!因为PI具有很强的粘附性,容易使细胞聚团!
常见问题解答
1.是否可以直接用乙醇固定细胞?
不可以,直接70~75%乙醇加入很容易导致细胞聚团现象,很难重悬成单细胞,影响固定效果,甚至容易导致固定后无细胞沉淀的现象。正确做法是:待细胞充分分散成单细胞后,缓慢地滴入无水乙醇中,使其终浓度为70~75%乙醇。
2.细胞量过少,无法获得数据结果?
▲首先,要保证收集足够的细胞样品(个人经验至少收集100万左右);如果药物处理后细胞死亡过多,应该降低药物浓度;
▲其次,固定细胞时先用预冷的PBS重悬细胞,再逐滴滴入无水乙醇中;
细胞清洗时,不可过度吹打细胞,以防产生过多的细胞碎片;
▲最后,尽量采用尖底的离心管和水平的离心机,离心后尽量用移液枪吸走上清,不要倾倒,残留一点,不要吸完;
3.什么样的数据结果可以用?
▲G2/M期细胞的DNA含量是G1期的2倍,在直方图上形成一个2倍于G1信号峰的高斯峰;
▲CV(变异系数)表示峰的宽度,CV值越小,峰形越好,最好是在5%左右,一般小于10%也被认可。
▲RCS最好是在1~3,高于5则不被认可。RCS高,说明数据的分布和软件所建立模型的预期值的差别比较大,可能由于处理细胞的时候RNA酶消化不好,或者是PI的浓度不佳造成的。
4.如何提高分辨率和精确度?
变异系数(Coefficient of Variation,CV值)反映G0/G1峰分辨率和精确度。而样品CV值为样品固有,与样本制备过程中细胞质量有关。细胞碎片越少、细胞聚团越少、RNA酶消化越充分,可以减少样本的CV值,提高G0/G1峰分辨率和精确度。
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