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限制性内切酶可以特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。
在平常酶切实验中，
总有一些因素导致结果不理想，
那么做好酶切应该注意哪些问题呢？
操作步骤中应注意哪些关键因素呢？
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如何做好酶切实验？
一、DNA质量
▲DNA的质量是决定酶切效率的最重要的因素。通常在克隆时，如果反复优化酶切条件后，都不能实现完全酶切，最可能的原因就是质粒DNA的质量有问题；
▲DNA的质量检测通常有两个方法：首先OD260/280比值应该在1.8左右（1.7-1.9），否则意味着DNA样品中存在大量的蛋白质或RNA污染。其次，琼脂糖电泳分析时应主要以超螺旋条带为主，最多不超过三条带（分别为超螺旋DNA，线性化DNA和环状DNA），否则意味着质粒DNA的质量不高，应该重新制备。
二、样品纯度
DNA中的杂质，如：氯仿、乙醇、SDS等，都会影响酶的活性。
一般采取以下措施：
▲纯化DNA；
▲加大酶用量；
▲延长酶催化反应的保温时间；
▲扩大反应体系（＞20ul）。
三、甲基化影响
从带有DNA甲基化酶基因的宿主菌中制备的DNA，其碱基的一部分已经被甲基化，因此即便使用能够识别、切断被甲基化部分的序列的限制酶，也几乎无法切断被甲基化的部分。被甲基化的部位，根据底物DNA及宿主种类的不同而不同。例如宿主菌为大肠杆菌的情况下，根据宿主的种类有以下两种情况：
在进行转化时，通常使用C600、HB101、JM109等菌株，因为都带有dam、dcm甲基化酶，所以使用这些菌株制备的DNA时，必须注意！另外，动物DNA中CG序列多为5mCG，植物DNA中CG及CNG序列多为5mCG和5mCNG。
四、反应温度
大部分酶的反应温度为37°C，从嗜热菌中分离出来的内切酶则有更高的要求温度，一般为50-65°C不等。
五、DNA分子结构
DNA分子的不同构型对限制性内切酶的活性有很大影响，某些限制性内切酶在切割超螺旋的质粒时需要的酶量比切割线性DNA时要高很多。
六、缓冲液
对于每一种酶都有相应的最佳缓冲液（不同公司的同一种buffer可以互换使用哦~），可保证几乎100%的酶活性，所以应选择合适的缓冲液，使用时的缓冲液浓度应为1X。有的酶要求100μg/ml的BSA才可实现最佳活性，在这种情况下，也相应有100X（如NEB公司）或10X（如Takara公司）的BSA，不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响。
七、反应时间
▲对于酶切鉴定试验（加酶量0.5-1μl，反应体系10-20μl，质粒DNA量在50-200ng），反应时间2-4h（如果时间比较紧的话可以1-2h）；
▲对于酶切后用于胶回收（加酶量1-2μl，反应体系30-50μl，DNA量在500-2000ng），反应时间3-6h；
▲对于反应条件不是很合适的时候(如双酶切时有一个酶的反应buffer不是很合适或者酶切位点在线性DNA的末端)最长16h。
▲为防止Star活性的产生，应将甘油的浓度控制在5%以下，要注意酶的体积不要超过总体积的10%（一般酶都贮存于50%的甘油中）。同时如果酶切时间过长可能会导致基因被切碎。
DNA酶切出现意外怎么应对？
不完全酶切或者完全切不开
▲可能原因❶：内切酶失活
▲推荐解决方案：
1.查看内切酶的有效期；
2.确保内切酶储存在-20℃，再低于此温度，内切酶活性可能受影响；
3.避免多次冻融（不超过3次），建议使用冰盒储存或取放内切酶；
4.勿将酶储存于无霜冰箱或冰箱开门处：
▲可能原因❷：酶切方案不佳
▲推荐解决方案：
1.按照内切酶供应商推荐的酶切方案及其所适用的DNA样本类型；
2.确保酶切反应中包含所需的添加物或酶辅因子（如DTT、Mg2+、ATP、活性腺苷甲硫胺酸）；
3.使用随酶提供的酶切缓冲液。双酶切时，按供应商的推荐，需考虑兼容性及其它所需反应条件；
4.按照供应商推荐的最适酶切温度进行酶切，双酶切时若两种内切酶最适温度不一致，按顺序先进行较低温度酶切，再进行较高温度酶切；
5.确保酶切过程中不会因蒸发而使酶切体积减小，否则会使盐浓度增高，从而可能降低酶的活性
▲可能原因❸：内切酶不恰当的稀释
▲推荐解决方案：
1.避免使用微量体积（<0.5μL）内切酶进行酶切，保证足量日常储备，确保每个反应所加酶量准确；
2.勿将内切酶稀释于水或10×反应缓冲液中；
▲可能原因❹：配制酶切体系不恰当
▲推荐解决方案：
1.在反应体系中最后加入内切酶，加入内切酶后轻弹混匀，确保内切酶不会因甘油密度而沉于管底；
▲可能原因❺：酶切反应混合液中甘油过多
▲推荐解决方案：
1.酶切反应混合液中甘油浓度应<5%，加入内切酶的量不超过总反应体积的1/10，尤其是对于双酶切；
2.避免因蒸发而使反应体积减小，从而导致甘油浓度增高；
▲可能原因❻：酶切DNA浓度不合适
▲推荐解决方案：
1.酶切反应混合液中DNA浓度的最佳范围为20-100 ng/µL；
▲可能原因❼：DNA污染
▲推荐解决方案：
1.通过离心柱纯化、酚氯仿抽提和乙醇沉淀去除残留的SDS、EDTA、蛋白、盐分、核酸酶，用70%冰冷乙醇漂洗DNA沉淀，以去除EDTA和盐分；
2.当酶切未经纯化的PCR产物时，PCR产物体积应不超过酶切总体积的1/3（如30 µL酶切总体积中PCR产物体积不超过10 µL）；
3.如果DNA是经硅膜或树脂纯化，需>10000×g离心10分钟已去除残余粒子；
▲可能原因❽：DNA中找不到内切酶识别序列
▲推荐解决方案：
1.重新检查DNA模板，或通过测序检查；
2.如果通过PCR引物引入酶切识别序列，确保引物序列包含酶切识别序列且5’端有4-8个保护碱基；
3.查看所用内切酶是否需要不止一个识别位点才能发挥完全活性，添加含识别序列的DNA寡核苷酸或亚精胺可提高那些至少需要两个识别位点内切酶的活性（如AarI、SfiI）；
▲可能原因❾：甲基化影响
▲推荐解决方案：
1.查看内切酶的甲基化敏感性。如果内切酶受识别序列甲基化影响，尝试用异裂酶或同裂酶替代（如MvaI替代EcoRII）；
2.为了避免DNA的甲基化，在dam–/dcm–型大肠杆菌中复制质粒；
3.如果内切酶需要识别序列甲基化才能发挥功能（如DpnI、SgeI），在dam+/dcm+型大肠杆菌中复制质粒；
▲可能原因❿：DNA结构影响
▲推荐解决方案：
1.对于超螺旋的质粒DNA，其酶切位点可能被包埋，使用经验证可消化完整质粒的内切酶，如有必要，适当加大酶用量（如每µg DNA 5-10 units酶）；
2.对于线性DNA而酶切位点临近末端，检查完全酶切所需的额外碱基；
3.如果在质粒多克隆位点内进行双酶切，检查酶切位点临近序列，是否具有进行完全酶切所需的碱基数量，如果距离太近，两种酶切可能会互相影响；
▲可能原因⓫：水中有杂质
▲推荐解决方案：
1.将水离心（10 min， 10000×g）以去除水中污染物；
2.做阴性酶切对照，以水代替酶以检测水中核酸酶和细菌污染物的影响；
3.推荐使用新鲜的无核酸酶、分子生物学级别的商品化水；
出现预期外的酶切条带
▲可能原因①：内切酶星号活性
▲推荐解决方案：
1.酶用量不要超过推荐用量，如有必要可适当减少酶用量；
2.避免过度长时间酶切；
3.使用推荐的反应缓冲液。低盐、不合适的PH、除了Mg2+外的二价阳离子可能引起星号活性；
4.确保酶切反应中甘油浓度不超过5%；
5.避免因蒸发而使反应体积减小，进而增大甘油浓度和盐浓度；
▲可能原因②：其它内切酶污染
▲推荐解决方案：
1.使用一管新酶或新缓冲液，不恰当的实验操作可能使内切酶或缓冲液被另一种内切酶污染；
▲可能原因③：其它DNA污染
▲推荐解决方案：
1.重新制备新的样本DNA；
出现弥散的DNA条带
▲可能原因❶：DNA质量差
▲推荐解决方案：
1.通过电泳检测未酶切的DNA，如观察到降解则重新纯化DNA；
▲可能原因❷：试剂污染
▲推荐解决方案：
1.如有必要，制备新的试剂，使用新的内切酶或者重新纯化DNA，不恰当的操作可能使反应组分被核酸酶污染；
▲可能原因❸：DNA迁移缓慢
▲推荐解决方案：
1.在电泳前加入含0.2% SDS上样缓冲液后，将酶切DNA在65℃加热10分钟，可使与底物DNA仍结合的酶分离；
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